Hoe te GSH Levels gebruik bij het detecteren ROS

Glutathion of GSH , is een niet-essentieel tripeptide gemaakt van cysteïne , glutamaat en glycine . Het is een krachtige antioxidant die de cellen en organen van het lichaam tegen de schadelijke effecten van ROS of reactieve zuurstofspecies , die worden gevormd uit moleculaire zuurstof als gevolg van diverse metabole processen in het lichaam beschermt . Antioxidanten , zoals glutathion , neutraliseren ROS en voorkomen dat ze interactie met en beschadiging van het DNA en eiwit in de cellen . De verhouding van geoxideerde en gereduceerde vorm van GSH in je lichaam is een indicatie van de ROS - gerelateerde oxidatieve stress in je body.Things je nodig hebt
Spuit
Butterfly naald
Centrifuge
Natriumheparine
Freezer
Sulfosalicylzuur
GSH Reaction Agent
Microplaat
Lichtbron
GSH standaardoplossing
Toon meer instructies
1

Draw ongeveer 2 ml bloed door venapunctie de anticubetal ader met een 23 - gauge vlinder naald bevestigd aan een spuit 5 ml . Voeg het monster aan buizen die natriumheparine testen en voorzichtig omkeren van de buis voor het mengen . Kopen van 2

Verzamel de rode bloedcellen door centrifugeren van het monster bij 2500 omwentelingen per minuut gedurende vijf minuten. Bevriezen en ontdooien van het monster drie keer om de cellen te breken . Centrifugeer het cellysaat gedurende 10 minuten bij 12.000 rpm en 4 ° , en verzamel de bovenstaande vloeistof .

3 Verwijder het eiwit uit het monster door het toevoegen van 5 procent sulfosalicylzuur en centrifugeren van het monster bij 12.000 rpm gedurende vijf minuten bij 4 graden . Bewaar het ontdaan supernatant bij -112 graden .
4

Meng een thiol opsporingsmiddel , GSH reductase , nicotinamideadeninedinucleotide fosfaat en assay buffer in proporties door de fabrikant aangegeven kit om de GSH reactiemengsel te maken. Het bedrag van elke chemische stof is afhankelijk van het aantal tests die u wilt uitvoeren . Verdun het reactiemengsel GSH 5 procent sulfosalicylzuur om concentraties van 16 , 32 , 63 , 125 , 250 en 500 microliter krijgen .
5

Voeg 1 tot 10 microliter van de ontdaan bloedmonster in de putjes van een microplaat . Voeg serie verdund GSH standaardoplossing , die in de test kit , aan elk putje tot het totale volume van elk putje tot 10 microliter brengen .
6

Voeg 90 microliter GSH reactiemengsel u gemaakte in stap 4 in elk putje van de microplaat . Meng het reagens door schudden van de plaat gedurende 30 seconden .
7

Meet de absorptie direct door het plaatsen van de plaat onder licht met golflengten van 405 en 415 nanometer . Incubeer de plaat gedurende 30 minuten . Neem absorptie metingen na elke vijf minuten tijdens de incubatie .
8

Verdun 6 millimolar van de verwerkte monster met 5 procent sulfosalicylzuur en trifluromethane sulfonaat oplossing . Dit alles zal de verminderde GSH verwijderen uit de oplossing . Voeg 1-10 micoliters van deze oplossing aan de putjes van de microtiterplaat en herhaal de stappen 5 , 6 en 7 . Dit zal helpen een schatting van de hoeveelheid geoxideerde GSH in de steekproef .
9

Teken de absorptie en monster concentraties op een grafiek om de GSH curve voor zowel gereduceerd en geoxideerd glutathion verkrijgen . Bereken de verhouding tussen beide vormen van GSH . Verhoogde oxidatieve GSH niveaus aangeven oxidatieve stress en ROS .