TOPO Cloning Protocols

TOPO klonering is een proces van klonen die gebruik algemeen 3' Een residuen die thermodynamisch onstabiel en combineert deze met een Taq DNA polymerase . Bovendien gebruikt de werkwijze een nieuwe polymerase kettingreactie product ( PCR ) die bij 4 ° C worden bewaard . Deze vorm van klonen optimaliseert de actieve topoisomerase I molecule toegevoegd aan het einde van een lineaire vector . Om TOPO klonen uit te voeren, moet een bepaald protocol te volgen . Voorbereiding

Enkele eenvoudige stappen kunnen worden genomen om de algehele TOPO klonen proces te versnellen en ervoor te zorgen het succes ervan. Eerst buizen levensvatbare cellen moeten op ijs geplaatst om de aanvaardbaarheid handhaven . Vervolgens moet de super optimale kweek ( SOC ) medium , bacteriegroei verrijkt met nutriënten , op kamertemperatuur gebracht . De selectieve platen moet dan vooraf worden verwarmd tot 37 graden Celsius , zodat ze volledig klaar wanneer het tijd is om ze te gebruiken .
Combineren Ingrediënten

Om het klonen te beginnen proces moet een combinatie van 2 microliter polymerase kettingreactie ( PCR ) product , 0,5 microliter zoutoplossing en 0,5 microliter kloneringsvector worden gecombineerd in een 0,5 ml centrifugebuis . Eenmaal gecombineerd , wordt deze ingrediënten moeten worden bij kamertemperatuur en geïncubeerd gedurende vijf tot tien minuten . Vervolgens zal de gecombineerde ingrediënten worden toegevoegd aan de " Top - 10 chemisch competente cellen " in een 50 - microliter buis en geplaatst op ijs voor een extra tien minuten . Hierna moet de cellen warmte geschokt op 42 graden Celsius precies en geplaatst op ijs voor een extra minuut voor 180 microliter van de SOC medium wordt toegevoegd . Dit mengsel moet vervolgens in horizontale richting worden geschud bij 200 rpm voor een extra uur bij 37 graden Celsius .
Final Steps

Een mengsel van 50 microliter en 100 microliter van elke reactie worden uitgeplaat " op LB + AMP + X - Gal platen en incubeer gedurende de nacht zonder schudden bij 37 C. " De volgende dag drie witte kolonies van elke reactie worden uitgekozen en geplaatst in 4 ml LB + AMP en gedurende de nacht incuberen bij een temperatuur van 37 graden Celsius , terwijl bij 200 rpm geschud wordt . De laatste stap is de mini - opstelling van de plasmiden en wachten om te zien of het proces succesvol is verlopen .